檢測(cè)原理

試劑盒采用雙抗原一-步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 。往預(yù)先包被病毒性腹瀉病毒抗ti的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗原，經(jīng)過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在suan的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450NM波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值) ，與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中豬病毒性腹瀉病毒(BVDV) 的存在與否。

樣品收集、處理及保存方法

1.血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.血漿: EDTA、檸檬suan鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.細(xì)胞上清液: 3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn) 離心10分鐘取上清。

5.保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20°C， 避免反

復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項(xiàng)

1.試劑盒保存在2-8°C，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完quan溶解后再使用。

2.實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封(低溫干燥)保存。

3.預(yù)處理后的樣本請(qǐng)按照操作步驟用樣ben稀釋ye適當(dāng)稀釋以達(dá)到試劑盒的的最jia檢測(cè)效果。.

4.嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.所有液體組分使用前充分搖勻。

小鼠Ⅱ型膠原(ColⅡ)ELISA試劑盒

常用方法：

1. 夾心法：

夾心法常用于檢測(cè)大分子抗原，一般的操作步驟為:

a. 將具有專一性的抗ti固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗ti

b. 加入待測(cè)檢體，檢體中若含有待測(cè)的抗原，則其會(huì)與塑膠孔盤上的抗ti進(jìn)行專一性鍵結(jié)

c. 洗去多余待測(cè)檢體，加入另一種對(duì)抗原專一的一次抗ti，與待測(cè)抗原進(jìn)行鍵結(jié)

d. 洗去多余未鍵結(jié)一次抗ti，加入帶有酶的二次抗ti，與一次抗ti鍵結(jié)

e. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗ti，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果

原理：針對(duì)抗原分子上2個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗ti分別作為固相抗ti和酶標(biāo)抗ti，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物。

2. 間接法

間接法常用于檢測(cè)抗ti，一般的操作步驟為：

a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余的抗原。

b. 加入待測(cè)檢體，檢體中若含有待測(cè)的一次抗ti，則其會(huì)與塑膠孔盤上的抗原進(jìn)行專一性鍵結(jié)。

c. 洗去多余待測(cè)檢體，加入帶有酶的二次抗ti，與待測(cè)的一次抗ti鍵結(jié)。

d. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗ti，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測(cè)定塑膠盤中的吸光值（OD值），以評(píng)估有色終產(chǎn)物的含量即可測(cè)量待測(cè)抗ti的含量。

原理：利用酶標(biāo)記的抗抗ti以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗ti。

3. 競(jìng)爭(zhēng)法

競(jìng)爭(zhēng)法是一種較少用到的ELISA檢測(cè)機(jī)制，一般用于檢測(cè)小分子抗原，其操作步驟為：

a. 將具有專一性的抗ti固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗ti

b. 加入待測(cè)檢體，使檢體中的待測(cè)抗原與塑膠孔盤上的抗ti進(jìn)行專一性鍵結(jié)

c. 加入帶有酶的抗原，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗ti進(jìn)行專一性鍵結(jié)，由于塑膠孔盤上固著的抗ti數(shù)量有限，因此當(dāng)檢體中抗原的量越多，則帶有酶的抗原可鍵結(jié)的固著抗ti就越少，亦即，兩種抗原皆競(jìng)相與塑膠孔盤上抗ti鍵結(jié)，即所謂競(jìng)爭(zhēng)法之由來。

d. 洗去檢體與帶有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，當(dāng)檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤內(nèi)留下之帶有酶的抗原越少，顯色也就越淺。

e. 當(dāng)需要偵測(cè)無法獲得兩種以上單一性抗ti的抗原，或是不易得到足夠的純化抗ti以固著于孔盤上時(shí)，一般會(huì)考慮使用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA。

實(shí)驗(yàn)過程:

1.試劑準(zhǔn)備:所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫,使用后請(qǐng)立即按照說明書要求保存試劑。實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng) 使用一次性的吸頭,避免交叉污染。

2.加樣:加樣或加試劑時(shí)，請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本/標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時(shí)，第yi個(gè)孔與最hou-一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)孵育“時(shí)間,從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品) 將控制在10分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用多道移液器加樣。

3.孵育:為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài):同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。

4.洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最hou的酶標(biāo)儀讀數(shù)。